外泌体(Exosome)是细胞分泌的微小囊泡,直径范围在30-150纳米之间,具有双层膜结构,天然存在于血液、尿液、唾液、母乳及细胞培养基等生物体液中。这些外泌体携带多种重要成分,如蛋白质、脂类、DNA和RNA等,广泛参与细胞间的通讯,发挥着在疾病诊断与治疗中的重要作用。由于外泌体在生物医学领域显示出的巨大潜力,其提取方法已成为研究的热点。为此,以下将详细介绍外泌体提取的原理及实验步骤。
一、提取原理
外泌体的提取主要依赖其独特的物理和化学特性,包括大小、密度及表面标志物等。常见的提取方法包括差速离心、密度梯度离心、磁珠免疫法、超滤法、聚合物沉淀法以及分子排阻法等。这些方法利用不同的物理或化学技术,将外泌体从复杂的生物样本中有效分离出来。
二、实验步骤
1、预处理:对于细胞培养的上清液,首先进行低速离心(如300g, 4℃离心10分钟)以去除死细胞和细胞碎片。对于血浆或尿液等生物体液,可能需进行更复杂的处理步骤,如去除血浆中的血小板和红细胞。
2、差速离心:
①第一次离心:将预处理后的样本进行初次离心,通常使用较低的离心力(2000g,4℃离心20分钟),以去除较大的颗粒和杂质。小心收集离心后的上清液,避免吸到沉淀物。
②高速离心:将收集的上清液转移至超速离心管,进行高速离心(100,000g,4℃离心70分钟或更长),使外泌体沉淀在管底。
3、洗涤与重悬:离心结束后,小心去除上清液,留下沉淀物。用预冷的PBS缓冲液轻柔洗涤沉淀物,以去除残留杂质。然后用适量的PBS缓冲液将洗涤后的沉淀重悬,得到外泌体悬液。
4、保存与检测:将提取的外泌体悬液分装至无菌的EP管,置于-80℃冰箱保存。同时,进行一系列检测以验证外泌体的纯度和质量,常用的方法包括纳米颗粒跟踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)观察、Western Blot检测外泌体标志蛋白等。
三、注意事项
1、操作温度:所有操作尽量在4℃条件下进行,以防止外泌体内容物降解和变性。
2、保护膜结构:在操作过程中,尽量减少对外泌体的压力和剪切力,以保护其膜结构的完整性。
借助这些先进的外泌体提取技术与方法,泛亚电竞 致力于推动生物医学研究的深入发展,开发出更加有效的疾病诊断和治疗方案。通过不断创新与技术积累,我们将为临床疾病提供更为精准的检测与治疗工具,提升整体医疗水平。